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两亲性壳聚糖连接低分子量聚乙烯亚胺为骨架的肿瘤靶向转基因载体的构建

化夏试剂:两亲性壳聚糖连接低分子量聚乙烯亚胺为骨架的肿瘤靶向转基因载体的构建

发布时间:2014-4-3   来源www.hx-r.com   供参考
基因治疗的本质是通过基因导入系统将外源基因导入靶细胞,通过遗传或分子生物学技术纠正或补偿基因缺陷和异常,以达到治疗疾病的目的。作为一种新的治疗手段,基因治疗可以克服包括肿瘤、遗传性疾病、心血管疾病和自身免疫缺陷等多种疾病,目前研究主要集中于肿瘤的治疗。基因治疗的关键是选择安全且高效的转基因载体,使目的基因高效作用于特定细胞且细胞毒性较小。转基因载体有病毒型和非病毒型两种。聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)因其结构中含有多种氨基,质子化后含丰富电荷而成为研究最为广泛的一种聚阳离子型非病毒转基因载体。然而PEI应用于转基因载体尚存在三个突出问题:第一,转染效率与细胞毒性存在矛盾:高分子量PEI转染效率高,但细胞毒性大;低分子量PEI细胞毒性小,但转染效率低。第二,体液稳定性与穿膜能力存在矛盾:通过增加亲水性来增加PEI体液稳定性将会降低PEI的穿膜能力,而不利于目的基因递送。第三,PEI的细胞靶向性差。由于PEI是靠静电相互作用与细胞结合,因此无法识别并作用于特定细胞。 壳聚糖(Chitosan, CS)是一种天然高分子化合物,由甲壳类动物的甲壳素脱乙酰基后得到,具有高生物相容性和低细胞毒性,也被用作转基因载体。但壳聚糖在生理条件下溶解度低,且表面电荷少,使其转染效率低,限制了其作为转基因载体的应用。 整合素是细胞表面受体的主要家族,对细胞和细胞外基质的粘附起介导作用。整合素是由α(120-185kDa)和β(90-110kDa)两个亚单位形成的异二聚体,已发现20余种,其中整合素αvβ3在多种肿瘤表面和新生血管内皮细胞中高表达,对肿瘤血管的生成起着重要作用,因此,整合素αvβ3成为抗肿瘤药物的作用靶点。 基于以上分析,本课题首先对壳聚糖CS进行改性,得到两亲性壳聚糖N-辛基-N-季铵化壳聚糖OTMCS,然后以其连接低分子量PEI(PEI2KDa),得到高分子量聚乙烯亚胺衍生物OTMCS-PEI。同时将特异亲和整合素αvβ3的RGD肽与细胞穿膜肽TAT(49-57)偶联,形成具有靶向于肿瘤细胞和提高穿膜效率的双功能肽RGDC-TAT(命名为R13)。最后,采用双功能肽R13修饰PEI衍生物OTMCS-PEI,得到新型转基因载体OTMCS-PEI-R13。 本文第一章介绍了聚乙烯亚胺与壳聚糖在转基因载体中的应用,包括聚乙烯亚胺的结构特性、对其进行不同的修饰得到的各种聚乙烯亚胺衍生物以及壳聚糖的结构特性、研究热点等。 第二章内容为OTMCS-PEI-R13的合成与表征。首先采用固相法制备双功能肽R13,并通过质谱测定其序列,HPLC测定其相对含量,并采用酶联免疫法检测R13与整合素αvβ3阳性的Hela细胞和B16细胞的亲和能力。壳聚糖CS依次与正辛醛、N-甲基吡咯烷酮在一定条件下反应得到两亲性壳聚糖N-辛基-N-季铵化壳聚糖OTMCS,进而采用三光气+琥珀酰亚胺法活化OTMCS并与PEI2KDa连接形成OTMCS-PEI高分子量衍生物。最后通过交联剂SMCC将R13按不同摩尔比与OTMCS-PEI偶联得到最终产物OTMCS-PEI-R13。各反应产物通过IR或1HNMR进行结构分析。结果表明,成功合成了双功能肽R13,其纯度达到95%,同时,R13表现出良好的肿瘤细胞亲和能力。成功合成了两亲性壳聚糖OTMCS,并采用三光气+琥珀酰亚胺法活化OTMCS并交联PEI2KDa,最后成功采用SMCC法将R13与OTMCS-PEI偶联形成最终产物OTMCS-PEI-R13。红外、核磁等结构表征表明目的产物修饰度高且纯度好,说明合成方法稳定、可控。 本文第三章考察了OTMCS-PEI和OTMCS-PEI-R13的理化性质。通过测定两种聚合物在37℃下不同时间点分子量来评价其水解性能;使用激光粒度仪和Zeta电位测定仪测定其粒径及表面电位;使用透射电镜观察其形态结构;通过凝胶电泳阻滞分析考察其包裹DNA的能力及对DNA的保护能力;采用MTT法评价两种聚合物对Hela细胞、B16细胞的毒性,并与PEI25KDa和PEI2KDa进行比较。结果表明,OTMCS-PEI-R13在37℃条件下可缓慢水解,大约60小时水解为小分子聚合物。与DNA形成的复合物呈类球形,粒径约150-250nm,电位适中。OTMCS-PEI与DNA质量比为0.6时可将DNA完全包裹,OTMCS-PEI-R13-l与DNA质量比为1时将DNA完全包裹,OTMCS-PEI-R13-h与DNA质量比为3时将DNA完全包裹,三者均具有较强DNA缩合能力。同时,OTMCS-PEI可保护DNA抵抗1100μg/mL肝素钠、3U DNase I/μg DNA的DNaseI及50%血清的解离,OTMCS-PEI-R13可保护DNA抵抗300μg/mL肝素钠、23.5U DNase I/μg DNA的DNase I及50%血清的解离。以上结果表明OTMCS-PEI和OTMCS-PEI-R13均具有很强的DNA保护能力。与高分子量PE(IPEI25KDa)相比,OTMCS-PEI与OTMCS-PEI-R13的细胞毒性显著降低,低浓度时与PEI2KDa毒性类似,即使在高浓度时仍保持60%以上细胞活度。 本文第四章考察了OTMCS-PEI/DNA、 OTMCS-PEI-R13-l/DNA及OTMCS-PEI-R13-h/DNA复合物体内外转染。以pEGFP-N2绿色荧光蛋白质粒和pGL3-Control虫荧光素酶质粒为报告基因,考察两种复合物在Hela细胞和B16细胞中的体外转染能力。荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,生物/化学发光仪定量检测虫荧光素酶表达情况。最后建立肿瘤模型,以pGL3-Control虫荧光素酶质粒作为报告基因,考察复合物在体内的分布和表达情况。结果表明,随着w/w升高,转染效率也逐渐升高,三种复合物的转染效率均显著高于PEI25KDa,尤其连接R13后,转染效率更大幅提高。体内试验表明,复合物在体内的转染效率同样优于PEI25KDa,偶联R13后,虫荧光素酶报告基因在肿瘤组织中表达增强,表明R13可明显改善复合物在体内的分布,可知OTMCS-PEI-R13在体内具有较强肿瘤靶向能力。 本课题通过合成两亲性壳聚糖N-辛基-N-季铵化壳聚糖OTMCS并与低分子量PEI连接形成高分子量聚乙烯亚胺衍生物,降低了细胞毒性;与双功能肽R13偶联后,提高了肿瘤靶向性和穿膜效率,进而提高了转染效率。最终合成了转染效率高、细胞毒性低的新型转基因载体OTMCS-PEI-R13,克服了PEI作为转基因载体使用中存在的问题。
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