2. 待TSC培养基冷至50℃左右，每250 mL培养基加过滤除菌的0.5%D-环丝氨酸溶液20.0 mL，(制作卵黄平板：加50%卵黄乳液20 mL到250 mL含D-环丝氨酸培养基中)，立即摇匀。

3. 倾注TSC琼脂到10个灭菌平皿中，每皿约5 mL，并迅速旋转平皿，使琼脂铺平。当琼脂凝固后，将每个平皿编号标记，以无菌操作，吸取稀释样品1 mL分别加到每个琼脂平板表面中心。再向平皿中倾注TSC琼脂15 mL，缓慢地旋转平皿，使其与接种物混合均匀。也可用L型玻璃棒，将0.1 mL样品稀释液均匀地涂布于含卵黄乳液的TSC琼脂上，将平板水平静置5-10 min使接种物被吸收。然后用不含卵黄的TSC琼脂10mL覆盖平板表层(含卵黄的TSC琼脂最适于同时含有其他还原亚硫酸盐梭状芽孢杆菌的食品)。

4. 琼脂凝固后，将平板正置于厌氧罐内，于36±1℃培养。不含卵黄的TSC琼脂平板培养20h，含卵黄的TSC琼脂平板培养24h。

5. 取出平板用肉眼观察生长情况和观察有无黑色菌落。挑选生长有20-200个黑色菌落的平板，用菌落计数器将黑色菌落计数并半算每 克食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌数。产气荚膜梭菌的菌落在含 卵黄的培养基上呈黑色。并通常有2-4mm宽的白色沉淀环(卵磷脂酶作用的结果)。但有少数菌株的卵磷脂酶反应较弱，或呈阴性。应对所有怀疑为产气荚膜梭 菌的黑色菌落进行计数，并做进一步的证实试验。

附：（1）D-环丝氨酸溶液：

溶解1gD－环丝氨酸于200mL磷酸盐缓冲液（c=0.05mol/L）(pH8.0±0.1)中(不加热),经0.45μm滤膜除菌。

（2）卵黄乳液：

用硬刷刷洗鲜蛋，沥干，放70%乙醇中浸泡1h。以无菌操作取出蛋黄，加等体积无菌0.85%氯化钠溶液，混合置4℃贮存。